海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)是一種從新生哺乳動物（通常為大鼠或小鼠）腦組織中分離海馬區(qū)神經(jīng)元，并在體外進(jìn)行無菌培養(yǎng)的實驗技術(shù)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)及神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默病、癲癇、腦缺血等）的研究。該方法能較好地保留神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)、電生理特性和突觸可塑性，是研究神經(jīng)發(fā)育、突觸傳遞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及藥物作用機(jī)制的重要體外模型。
實驗流程主要包括：在無菌條件下快速取出新生1–3天（P1–P3）乳鼠的腦組織，剝離海馬結(jié)構(gòu)，經(jīng)胰蛋白酶或木瓜蛋白酶消化后，用機(jī)械吹打或移液分散成單細(xì)胞懸液；隨后通過離心和重懸，將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸或?qū)诱尺B蛋白包被的培養(yǎng)皿或蓋玻片上，置于含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如Neurobasal）并添加B27補(bǔ)充劑、谷氨酰胺及抗生素的培養(yǎng)體系中。為抑制膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖，通常在培養(yǎng)24–48小時后加入阿糖胞苷（Ara-C）。
一、實驗前準(zhǔn)備
動物選擇
年齡：通常選用胚胎期（E18-E19）或新生（P0-P1）大鼠/小鼠的海馬組織。胚胎期神經(jīng)元分化程度低，存活率高；新生動物操作更簡便，但需注意解剖技巧。
健康狀態(tài)：確保母鼠/幼鼠健康，無感染或疾病，避免影響神經(jīng)元活性。
器材與試劑
無菌條件：所有器械（如手術(shù)剪、鑷子、培養(yǎng)皿）需高壓滅菌，操作在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。
培養(yǎng)基：常用Neurobasal培養(yǎng)基（含B27補(bǔ)充劑），避免使用血清（可能含抑制神經(jīng)元生長的因子）。
消化酶：木瓜蛋白酶或胰蛋白酶（濃度需優(yōu)化，通常0.125%-0.25%），避免過度消化損傷細(xì)胞。
多聚賴氨酸（PLL）：用于包被培養(yǎng)皿/蓋玻片，促進(jìn)神經(jīng)元貼壁生長（濃度0.1 mg/mL，37℃孵育1小時或4℃過夜）。
二、解剖與取材
快速操作
胚胎期取材需在母鼠麻醉后迅速剖腹取出子宮，置于預(yù)冷的HBss或D-Hanks緩沖液中。
新生動物需用冰浴麻醉（減少痛苦），快速斷頭后取出腦組織。
海馬分離
胚胎期：在解剖顯微鏡下用鑷子剝離腦膜，分離海馬體（呈C形結(jié)構(gòu)，位于大腦半球內(nèi)側(cè)）。
新生動物：需先去除小腦和腦干，再分離海馬，操作需輕柔以避免損傷組織。
消化與分散
酶消化：將海馬組織剪碎后加入消化酶，37℃孵育15-30分鐘（根據(jù)酶濃度調(diào)整時間），期間輕柔吹打促進(jìn)細(xì)胞分散。
終止消化：加入含血清的培養(yǎng)基或FBS終止反應(yīng)，離心（800-1000 rpm，5分鐘）去除酶液。
三、接種與培養(yǎng)
細(xì)胞密度
接種密度需優(yōu)化，通常為1×10?-5×10?cells/cm²。密度過低導(dǎo)致神經(jīng)元孤立，難以形成網(wǎng)絡(luò)；密度過高則資源競爭激烈，影響存活。
培養(yǎng)條件
溫度與CO?：37℃，5%CO?恒溫培養(yǎng)箱。
換液：s次全量換液在接種后24小時（去除未貼壁細(xì)胞和碎片），之后每3-4天半量換液（避免營養(yǎng)波動）。
避免擾動：換液時沿培養(yǎng)皿壁緩慢加入，減少機(jī)械刺激。
神經(jīng)元純度
抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長：可添加阿糖胞苷（Ara-C，5μM）于培養(yǎng)第2-3天，抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖（需嚴(yán)格控制濃度和時間，避免毒性）。
免疫熒光鑒定：培養(yǎng)7-10天后，用MAP2（神經(jīng)元標(biāo)記）和GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記）抗體檢測純度（理想純度>90%）。
四、關(guān)鍵注意事項
無菌操作
全程佩戴手套、口罩，避免說話或咳嗽污染樣本。
所有試劑需過濾除菌（0.22μm濾膜），培養(yǎng)基分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
避免毒性物質(zhì)
禁用含重金屬或酚紅的培養(yǎng)基（可能干擾神經(jīng)元活性）。
避免使用塑料器材釋放的雙酚A（BPA），選擇醫(yī)用級或特殊處理的培養(yǎng)皿。
機(jī)械保護(hù)
運輸或轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿時需輕拿輕放，避免震動導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。
蓋玻片需用凡士林或硅膠密封邊緣，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。
時間控制
從解剖到接種需在1-2小時內(nèi)完成，避免組織長時間暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
消化時間需精確，過度消化會破壞細(xì)胞膜，不足則細(xì)胞團(tuán)塊難以分散。
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